速速查收：双萤光素酶报告基因检测常见失败原因及解决方案！
双萤光素酶报告基因检测（DualLuciferaseReporterAssay）广泛应用于启动子活性分析、转录因子调控研究、miRNA靶向验证等实验。然而，由于实验流程复杂，涉及载体构建、细胞转染、裂解检测等多个环节，容易出现各种问题。本文将系统梳理常见失败原因及解决方案，帮助大家高效完成实验。
01 发光值过高或过低
1.发光值过高
样品本身发光值高：发光值过高可能会超出仪器检测范围，从而检测不到值，一般读数在5-6位之间较好。
解决方案：
a.减少质粒转染量；
b.细胞样品裂解后，离心取上清后对裂解产物进行稀释后检测。
2.发光值过低
1）转染效率太低：报告基因质粒无法成功进入细胞或较少进入细胞，会导致检测出的发光值较低。
解决方案：
a. 优化转染条件，用较易转染的质粒做阳性对照（如转染过表达萤光蛋白质粒）；
b. 确保转染DNA的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定；
c. 选择状态较好，处于对数分裂期的细胞进行转染；
d. 选择合适的转染试剂。
2）载体选择不当：萤火虫萤光素酶载体启动子活性不足，导致信号过低；海肾萤光素酶（RenillaLuciferase）使用强启动子（如CMV/SV40），干扰主报告基因检测。
解决方案：
a.萤火虫萤光素酶：推荐使用pGL3、pGL4或pmirGLO载体，确保启动子活性。
b. 海肾萤光素酶：建议选用phRLTK或pGL4载体，采用中等强度启动子（如TK）。
3）载体比例失衡：萤火虫与海肾萤光素酶质粒比例不当，导致内参信号过高或过低。
解决方案：
预实验优化比例，确保表达后的萤火虫萤光素酶信号显著高于海肾萤光素酶信号。
4）裂解不充分：细胞裂解不完全，萤光素酶未充分释放。
解决方案：
a.裂解液足量，冰上裂解5-10min，可适当吹打，确保细胞完全破碎。
细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好，长时间培养后，细胞可能会难裂解。
5）检测过程操作不规范：不规范的检测条件也有可能使得读值偏低。
解决方案：
a. 需加入足量底物，保证底物饱和，否则会造成结果偏差；
b. 室温反应，反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温；
c. 加完底物后可立即检测，萤光素酶的半衰期一般约30min，尽量在30min内完成，否则读值会偏小。
6）底物氧化失效：无法正常进行反应。
解决方案：
a. 底物避光密封保存，萤火虫荧光素酶底物-20℃保存，海肾荧光素酶底物推荐-80℃保存；
b. 反应工作液现用现配。
02 不同复孔发光值差异大
1.样本均一性不好：
由于操作误差导致每孔细胞数不一致、细胞状态差异等，导致每孔检测结果差异较大。
解决方案：
a. 细胞裂解后建议离心取上清，保证样本的均一性；
b. 移液器需定期校准，确保移液精准；
c. 接种细胞时严格进行细胞计数；
d. 避免气泡出现。
注：荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏，复孔之间的数值有一定差异是正常的，一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。
双萤光素酶实验结果的好坏取决于载体设计、转染效率、裂解条件、检测方法等等。通过优化实验流程，并选择高稳定性检测系统，即可显著提升检测成功率。
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