LDH Cytotoxicity Assay Kit；乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒

产品简介

乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit), 也被称为乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(LDH Release Assay Kit) ，主要用于检测样品中 LDH 含量。

LDH（乳酸脱氢酶）是一种广泛存在于各类生物体中较为稳定的胞浆酶，细胞状态正常时不能通过细胞膜， 当细胞受损或死亡时可释放到细胞外。释放到培养基上清中的 LDH 可通过偶联酶反应来定量检测。在 LDH  的作用下，NAD+被还原生成 NADH，NADH 和 INT（2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride） 被硫辛酰胺脱氢酶（Diaphorase）催化反应生成 NAD+和红色的甲臜(Formazan） ，甲臜的量与裂解（死  亡）细胞的数量成正比，在 490nm 波长下产生吸收峰，因此可通过吸光度检测来判断样品中 LDH 的活性。 本试剂盒可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中 LDH 的活性。一个试剂盒可进行 500 次检测。

 

产品规格

货号	C331303E
规格	500 T

 

组分信息

组分编号	组分名称	产品规格（500 T）	储存方法
C331303-A	Cell Lysis Buffer 细胞裂解液	7.5 mL	-20℃
C331303-B	Substrate Mix 反应底物	10 mL	-20℃
C331303-C	INT Substrate Solution (10×) INT 溶 液（10×)	1 mL	-20℃避光
C331303-D	INT Dilution Buffer INT 稀释液	10 mL	-20℃
C331303-E	Enzyme Solution 酶溶液	5 mL×2	-20℃ ,  避免反复冻融

 

储存条件

冰袋运输。-20℃保存 ，1 年有效。其中酶溶液避免反复冻融 ，INT 溶液(10×)需避光保存。

 

注意事项

1.      建议样品准备好后尽量当天完成检测。冷冻会使样品中部分乳酸脱氢酶失活 ，4℃可放置 2-3 天。

2.     由于血清中含有乳酸脱氢酶 ，建议血清的使用浓度不要超过 1% ，并最好使用热灭活血清。如果一定  需要使用 10%血清 ，在检测时务必设置没有细胞但加入了相同体积培养液的对照孔 ，用于消除背景。

3.     细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差大 ，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。

4.     如果希望进行乳酸脱氢酶活性的绝对定量 ，需自备乳酸脱氢酶标准品。

5.     操作过程中要避免气泡的出现 ，气泡会影响吸光值读数。

6.     吸取细胞时需温和操作 ，力度过大会造成自发性 LDH 释放 ，影响结果。

7.     为了您的安全和健康 ，请穿实验服并戴一次性手套操作。

8.     本产品仅用于科研。

 

使用说明

1.     样品准备：

1.1   LDH 释放检测

       1)     根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到 96 孔细胞培养板中 ，使待测时细胞密度不超 80-90%。

2)     吸去培养液 ，用 PBS 洗涤一次。更换新鲜培养液(推荐使用含 1%血清的低血清培养液或适当的无血     清培养液)，将各培养孔分成如下几组：无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细   胞孔(样品对照孔) ，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔) ，以及药物处理     的细胞孔(药物处理样品孔) ，并做好标记。按照实验需要给予适当药物处理(如加入 0-10 μL 左右特定   的药物刺激 ，可设置不同浓度 ，不同处理时间 ，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照) ，继续常规培     养。到预定的检测时间点前 1 小时 ，从细胞培养箱里取出细胞培养板 ，在“样品最大酶活性对照孔” 中加入试剂盒提供的细胞裂解液，加入量为原有培养液体积的 10%。加入细胞裂解液后，反复吹打数   次混匀 ，然后继续在细胞培养箱中孵育。

3)     到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机 400 g 离心 5 min。分别取各孔的上清液 120 μL，加 入到一新的 96 孔板相应孔中 ，随即进行样品测定。

1.2   细胞内总 LDH 的检测

1)     细胞毒性检测：根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到 96 孔细胞培养孔板中 ，使待检测时细 胞密度不超过 80-90%。加入不同药物进行处理 ，并设置适当对照。药物刺激完毕后 ，将细胞培养板 用多孔板离心机 400 g 离心 5 min。尽量吸除上清 ，加入 150  μL 用 PBS 稀释 10 倍的试剂盒提供的 细胞裂解液(10 体积 PBS 中加入 1 体积细胞裂解液并混匀) ，适当摇晃培养板混匀 ，然后继续在细胞 培养箱中孵育 1 小时。随后将细胞培养板用多孔板离心机 400 g 离心 5 min。分别取各孔的上清液 120 μL ，加入到一新的 96 孔板相应孔中 ，随即进行样品测定。

2)    细胞增殖检测：根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到 96 孔细胞培养孔板中 ，使促进细胞增 殖的药物刺激后细胞不超过 80-90%为宜。使用不同的药物刺激细胞 ，并设置适当对照。药物刺激完 毕后 ，将细胞培养板用多孔板离心机 400g 离心 5 min。尽量吸除上清 ，加入 150  μL 用 PBS 稀释了

10 倍的试剂盒提供的细胞裂解液(10 体积 PBS 中加入 1 体积细胞裂解液并混匀) ，适当摇晃混匀 ，然 后继续在细胞培养箱中孵育 1 小时。随后将细胞培养板用多孔板离心机 400 g 离心 5 min。分别取各 孔上清液 120  μL ，加入到一新的 96 孔板相应孔中 ，随即进行样品测定。

【注】 ：LDH 释放检测更为常用 ，细胞内总 LDH 检测通常可以用 MTT、WST-1 或 CCK-8 等方法替代。

2.     试剂盒的准备工作：

1)     INT 溶液(1×)的配置：根据所需的 INT 溶液(1×)的量，取适量 INT 溶液(10×)用 INT 稀释液稀释至 1  ×。例如 ，取 20  μL INT 溶液(10×) ，加入 180  μL INT 稀释液 ，混匀后即为 200  μL INT 溶液(1×)。 INT 溶液(1×)宜现配现用 ，配置后 4℃保存可于当天使用 ，不宜配置后冻存。

2)     LDH 检测工作液的配制：根据待测定的样品数(含对照) ，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工 作液。【注】 ：LDH 检测工作液必须现配现用 ，配制和使用过程中均要注意适当避光。

检测次数	1 次	10 次	20 次	50 次
反应底物	20 μL	200 μL	400 μL	1 mL
INT 溶液(1×)	20 μL	200 μL	400 μL	1 mL
酶溶液	20 μL	200 μL	400 μL	1 mL
总体积	60 μL	600 μL	1.2 mL	3 mL

      3)     （选做）如果希望进行 LDH 酶活性的绝对定量 ，需自备 LDH 标准品 ，并新鲜配制不同浓度 LDH 标

准品 ，如 10 mU/mL、 5 mU/mL、2.5 mU/mL、1.25 mU/mL、0.65 mU/mL、0 mU/mL。

3.     样品测定：

      1)     各孔分别加入 60  μL LDH 检测工作液。

2)     混匀 ，室温(约 25℃)  避光孵育 30 min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后  在 490 nm 处测定吸光度。可使用 600 nm 或大于 600 nm 的任一波长作为参考波长进行双波长测定。

      3)     计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)

细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度－ 样品对照孔吸光度) / (细胞最大酶活性的吸光度－ 样品对照 孔吸光度)×100

4)     可绘制细胞毒性曲线：纵坐标为实际吸光度，横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特定时间的 半致死剂量 LD50。

 

【附 1   LDH 酶活性的相对定量】：

可同时测定一已知浓度的 LDH 酶标准品对应的吸光度值 ，参考以下公式粗略计算出样品中 LDH 酶活力：

待测样品中 LDH 活力单位(mU/mL) ＝(样品孔 OD490－背景空白对照孔 OD490) / (标准管 OD490－标准空白管

OD490)×标准品浓度(mU/mL)；根据计算结果可以比较不同样品处理组间有无统计学差异等。

【附 2  LDH 酶活性的绝对定量】：

若需准确计算出 LDH 酶活性的绝对活性 ，可通过一系列 LDH 标准品及相应测得的吸光度值绘制标准曲线, 通过标准曲线相应公式计算出样品中 LDH 的酶活性。

各孔数值减去空白对照后 ，以检测的吸光度(OD490)为纵坐标 ，LDH 酶活力(mU)为横坐标 ，绘制 LDH 标准 曲线。同时计算出该趋势线的公式。

A490nm ＝k×LDH 酶活力单位(mU)＋b ，通过 Excel 等软件计算出趋势线的斜率 k 和截距 b。