产品简介

TUNEL Apoptosis Detection Kit, Alexa Fluor 640 细胞凋亡检测试剂盒可以用来检测组织细胞在晚期凋亡 过程中细胞核 DNA 的断裂情况。检测原理：在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT） 的作用下 ，基因组 DNA 断裂时暴露出的 3 ´-羟基（3 ´-OH）末端掺入 Alexa Fluor

640-12-dUTP ，因此可以用荧光显微镜或流式细胞仪检测。Alexa Fluor 640 染料稳定性更高 ，信号更强， 从而使标记物更亮 ，抗淬灭能力更强。

本试剂盒应用范围广 ，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况 ，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细 胞的凋亡情况。

 

产品规格

货号	C331411E/C331411S/C331411M
规格	20 T/50 T/100 T

 

组分信息

组分编号	组分名称	C331410E	C331410S	C331410M
C331411-A	5×Equilibration Buffer	750 μL	1.25 mL×2	1.25 mL×3
C331411-B	Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix	100 μL	250  μL	250 μL×2
C331411-C	Recombinant TdT Enzyme	20 μL	50 μL	50 μL×2
C331411-D	Proteinase K (2 mg/mL)	40 μL	100 μL	100 μL×2
C331411-E	DNase I (1 U/μL)	5 μL	12.5  μL	25 μL
C331411-F	10×  DNase I Buffer with MgCl2	100 μL	250  μL	500  μL

 

储存条件

冰袋（wet ice）运输。本试剂盒储存在-20℃ ,  Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix 避光储存于-20℃ , 有效期为 1 年。

 

注意事项

1.     需自备用于洗涤细胞的 PBS ，用于封片的抗荧光淬灭封片液 ，用于固定的 4%多聚甲醛。

2.     为了您的安全和健康 ，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3.     本产品仅用于科研。

 

使用说明

1.     样品准备

1)      石蜡包埋组织切片

a.      室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡 5 min ，重复一次 ，以彻底脱掉石蜡。

b.      室温下用 100%乙醇浸泡切片 5 min ，重复一次。

c.      室温下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗 1 次 ，每次 3 min。

d.     用 PBS 轻轻润洗切片 ，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样 品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中切勿让样品干燥，处 理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

e.      按 1:100 的比例 ，用 PBS 作为稀释液来稀释 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其终浓度为 20 μ g/mL。

f.       每个样本上滴加100  μL 浓度为 20  μg/mL 的 Proteinase K 溶液，使其被全部覆盖，室温孵育 20 min。 【注】 Proteinase K 帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗

涤步骤中从载波片上脱落的风险 ，过短则可能造成透性处理不充分 ，影响标记效率。为得到更好的结果， 可能需要优化 Proteinase K 孵育的时间。

g.      PBS 溶液润洗样本 2-3 次 ，轻轻去掉多余液体 ，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理 后的样本放在湿盒中保持样本湿润。

2)      组织冰冻切片

a.      取出冰冻切片 ，并回温至室温。将玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液（溶于 PBS） 中固定 ，室温下孵育 30 min。

b.      轻轻去掉多余液体 ，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。

c.      将玻片浸没在 PBS 溶液中 ，室温孵育 15 min ，重复 PBS 洗一次 ，共 2 次。

d.      轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周 围描绘样品分布的轮廓 ，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥 ，处理 好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

e.      按 1:100 的比例 ，用 PBS 作为稀释液来稀释 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其终浓度为 20 μ g/mL。

f.       每个样本上滴加100  μL 浓度为 20  μg/mL 的 Proteinase K 溶液，使其被全部覆盖，室温孵育 10 min。 【注】 Proteinase K 帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗

涤步骤中从载波片上脱落的风险 ，过短则可能造成透性处理不充分 ，影响标记效率。为得到更好的结果， 可能需要优化 Proteinase K 孵育的时间。

g.      在盛有 PBS 溶液的敞口烧杯中润洗样本 2-3 次。

【注】为了避免在清洗步骤中的样本脱片损失 ，建议不用洗瓶清洗 ，而是将玻片浸在 PBS 溶液中 2-3 次进 行清洗。

h.      轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本 的湿润。

3)      细胞样品

a.      在 Lab-Tek 载波片小室（Chamber Slides）上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用 PBS 洗 2 遍 载玻片。

b.      多聚赖氨酸包被的载玻片的准备：吸取 50-100  μL 0.01%(w/v)多聚赖氨酸水溶液滴至每一片预清洗 过的玻璃载玻片的表面。在将要用于固定细胞的区域将多聚赖氨酸溶液涂散为一薄层。待载玻片晾干 之后 ，迅速用去离子水漂洗 ，然后让包被后的载玻片在空气中晾干 30-60 min。包被后的载玻片能在 室温储存数月。

c.      以约 2×107 个细胞/mL 的浓度将细胞重悬于 PBS 中 ，吸取 50-100  μL 细胞悬液滴于多聚赖氨酸包 被的载玻片上 ，用一片干净的载玻片轻柔的涂开细胞悬液。

d.      固定细胞 ，将载玻片浸入装有 4%新鲜配制于 PBS 中的多聚甲醛的染色缸中 ，在 4℃放置 25 min。

e.      洗涤载玻片 ，将其浸入 PBS 中 ，室温放置 5 min。重复用 PBS 洗一次。

f.       轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周 围描绘样品分布的轮廓 ，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥 ，处理 好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

g.      按 1:100 的比例 ，用 PBS 作为稀释液来稀释 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其终浓度为 20 μ g/mL。

h.      每个样本上滴加 100  μL 浓度为 20  μg/mL 的 Proteinase K 溶液，使其被全部覆盖，室温孵育 5 min （也可浸于 0.2%配制于 PBS 中的 Triton X-100 溶液中 ，室温孵育 5 min 进行通透处理）。

【注】 Proteinase K 帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗 涤步骤中从载波片上脱落的风险 ，过短则可能造成透性处理不充分 ，影响标记效率。为得到更好的结果 ， 可能需要优化 Proteinase K 孵育的时间。

i.       PBS 润洗样本 2-3 次 ，轻轻去掉多余液体 ，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的 样本放在湿盒中。

2.     DNA 酶处理阳性对照的步骤

在样本通透处理后，用 DNA 酶 I 处理细胞来准备阳性对照载玻片。该流程通常会引起被处理的大多数细胞 显现绿色荧光。

【注】 DNA 酶 I 处理固定的细胞会引起染色体 DNA 的断裂 ，产生许多可标记的 DNA 3 ´-末端。

1)      按 1:10 的比例用去离子水稀释 10×DNase I Buffer(每个样本需用 200 µL 1×DNase I Buffer，即需 要用 20 µL 10×DNase I Buffer 和 180 µL 去离子水混合稀释) ，取其中 100 µL 滴加到已通透的样本  上，室温孵育 5min。 向剩余 100  μL 1×DNase I Buffer 中加 1  μL DNase I (1U/μL)，使其终浓度为 10 U/mL。

2)      轻轻叩掉液体 ，加入 100  μL 含 10 U/mL DNase I  的缓冲液 ，室温孵育 10 min。

3)      轻叩载玻片 ，去掉多余的液体 ，并将载玻片在装有去离子水的染色缸中彻底洗 3-4 次。

【注】 阳性对照载玻片必须使用单独的染色缸 ，否则阳性对照载玻片上残余的 DNase I  可能会在实验载玻 片上引入高背景。

3.     标记与检测

1)      按 1:5 的比例用去离子水稀释适量 5×Equilibration Buffer（每个样品需要 100  μL 1×Equilibration Buffer）。

2)      每个样本滴加 100  μL 1×Equilibration Buffer 使其全部覆盖待检样本区域 ，室温孵育 10-30 min。 或者将载玻片放入一个含有 1×Equilibration Buffer 的缸中，保证缓冲液没过样本。在平衡细胞的同 时在冰上解冻 Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix ，并依照表 1 ，准备足够量的用于所有实验的  和可选阳性对照反应的 TdT 孵育缓冲液。对于面积小于 5 cm2 的一个标准反应，其体积是 50  μL，用50 μL 乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需 TdT 孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样 本 ，可成比例的增大试剂体积。

表 1  准备用于实验的和可选阳性对照反应的 TdT 孵育缓冲液

组分	体积  (μL /50 μL 体系）
ddH2O	34
5×Equilibration Buffer	10
Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix	5
Recombinant TdT Enzyme	1

阴性对照体系：准备一份不含 TdT 酶的对照孵育缓冲液 ，用 ddH2O 替代 TdT 酶。

3)      在平衡后的区域周围用吸水纸洗掉 100  μL 1×Equilibration Buffer 中的大部分，然后在 5 cm2 面积 的细胞上加入 50 μL TdT 孵育缓冲液。不要让细胞干掉。这之后的操作 ，载玻片要避光。

4)      把塑料盖玻片盖在细胞上以保证试剂的平均分布，在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾。将载玻片置于 湿盒内 ，在 37℃孵育 60 min。将湿盒用铝箔纸包裹以避光。

【注】 塑料盖玻片在使用前可以切成两半。折起盖玻片的边缘以便于移除和操作。

5)      移除塑料盖玻片 ，并将切片置于 PBS 溶液中室温孵育 5 min ，换用新鲜 PBS 再重复清洗 2 次。

6)      用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的 PBS 溶液。

【注】 为了降低背景 ，载玻片在用 PBS 洗一遍后 ，可再用含 0.1% Triton X-100 和 5 mg/mL BSA 的 PBS 洗 3 次 ，每次 5 min ，这样游离的未反应的标记物可以清楚较干净。

7)      样本在染色缸中染色，在黑暗中将载玻片浸入装有 PI 溶液（1  μg/mL，用 PBS 新鲜配制并稀释）的 染色缸 ，室温放置 5 min。（可选） ：样本在染色缸中染色 ，在黑暗中将载玻片浸入装有 DAPI 溶液  （2  μg/mL ，用 PBS 新鲜配制并稀释） 的染色缸 ，室温放置 5 min。

8)      洗涤样本 ，将载玻片浸入去离子水中 ，室温放置 5 分钟。重复两次 ，总共洗三次。

9)      叩干载玻片上多余的水并向样本区域加 100  μL PBS 保持样本湿润。、

10)    立即在荧光显微镜下分析样本 ，在 620 nm 下检测 Alexa Fluor 640-12-dUTP 红色荧光 ，在 460 nm 观察蓝色的 DAPI。DAPI 能将凋亡和未凋亡的细胞都染成蓝色，只在凋亡的细胞核中才有 Alexa Fluor 640-12-dUTP 掺入而定位的红色荧光。如有必要 ，载玻片能在 4℃黑暗条件下存放过夜。

【注】 PI/DAPI 能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色 ，只在凋亡的细胞核中才有 Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix 掺入而定位的绿色荧光。