2× High-Fidelity PCR Master Mix (With Dye)；2×一代高保真PCR预混液（含染料）

产品简介

本品是即用型2×预混合溶液，包含High-Fidelity DNA Polymerase，dNTPs以及优化的缓冲体系。预混液中添加了常温可抑制聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性的两种单克隆抗体，可简便地进行高特异性的Hot Start PCR。预混液中添加了延伸因子使得该酶具有长片段扩增能力，扩增目的片段的长度可长达13 kb，该酶具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，其保真性是Taq DNA聚合酶的83倍，是普通Pfu DNA聚合酶的9倍。适用于复杂模板的扩增，扩增产物为平末端。

本试剂盒具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，反应体系只需加入引物和模板即可，并可以通过两步法的程序进行扩增，简化了实验步骤，节省了时间。本产品中含有电泳指示染料，PCR产物可直接进行电泳。另外，该产品还含有特异保护剂，使得预混液反复冻融后仍可维持稳定活性。

产品规格 

产品货号	N132014S	N132014M	N132014L
产品规格	1 mL	5×1 mL	100×1 mL

组分信息

组分编号	组分名称	N132014S	N132014M	N132014L
N132014	2×High-Fidelity PCR Master Mix (With Dye)	1 mL	5×1 mL	100×1 mL

产品储存

-25~-15℃保存，有效期1年。

操作注意

1) 为了您的安全和健康，请穿实验服、佩戴口罩、眼罩、一次性手套等采取防护性措施进行实验操作。

2) 本产品仅作科研用途！

操作说明

推荐PCR反应体系

表1 PCR反应体系

组分	体积（μL）	终浓度
DNA模板***	适量	-
Forward Primer (10 μM)**	2 μL	0.4 μM
Reverse Primer (10 μM)**	2 μL	0.4 μM
2×High-Fidelity PCR Master Mix (With Dye)*	25 μL	1×
RNase-free ddH2O	to 50 μL	-

【注】：

1) *在终浓度1×预混液含有1 U/50 μL的聚合酶、2 mM Mg2+和200 μM的dNTPs。

2) ** PCR反应体系中引物终浓度的范围为0.2-1 μM，推荐0.4 μM。

3) ***不同模板的推荐使用量（25 μL反应体系）:

模板种类	扩增片段1 kb-10 kb
基因组DNA	50 ng-200 ng
质粒或病毒DNA	10 pg-20 ng
cDNA	1-2.5 μL（不超过PCR反应总体积的1/10）

推荐PCR反应程序

1) 两步法程序(优先推荐)

表2 PCR反应程序

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	98℃	3 min	1
变性	98℃	10 sec	30-35
延伸	68℃	30 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

2）三步法程序(常规程序)

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性*	98℃	3 min	1
变性	98℃	10 sec	30-35
退火**	60℃	20 sec
延伸***	72℃	30 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

【注】：

a. *预变性温度和时间：推荐温度：98°C，时间：3 min，高GC含量模板5-10 min。

b. **退火温度和时间：推荐温度：60°C，也可根据需要，设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间设置为20 sec，可以在10-30 sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。

c. ***延伸温度和时间：推荐温度：72°C。时间：30 sec/kb，复杂模板根据实际情况可延长至60 sec/kb。

3）梯度温度退火程序(难扩增基因推荐程序)

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	98℃	3 min	1
变性	98℃	10 sec	15，每个循环降低1℃
梯度退火	70-55℃	20 sec
延伸	72℃	30 sec/kb
变性	98℃	10 sec	20
正常退火	55℃	20 sec
延伸	72℃	30 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

4）不同扩增程序下的特点

程序类型	两步法	三步法	梯度退火
速度	最快	中等	慢
特异性	高	中等	高
PCR产量	中等	最高	中等
检出率	高	中等	高