2× Color qPCR Fluore Green Master Mix (No Rox) 可示踪qPCR染料法预混液（无ROX）

产品简介

2×Color qPCR Fluore Green Master Mix (No Rox)是2×实时定量PCR扩增预溶液，扩增产量高，荧光强度高，灵敏度高和特异性强。核心组分Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增，同时添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽泛的定量区域内获得良好的线性关系。

本产品利用不同染料的混合变色反应来监控移液操作，有效减少了移液误差的发生。

产品信息

货号	N132034E	N132034S
规格	50 T（20 μL/rxn）	250 T（20 μL/rxn）

组分信息

组分编号	组分名称	N132034E	N132034S
N132034-A	2×Color qPCR Master Mix (No Rox)	1 mL	5×1 mL
N132034-B	10×Dilution Buffer	1 mL	1 mL

储存条件

-25~-15℃避光保存，有效期1年。

注意事项

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

3. 使用前请上下颠倒以混匀Master Mix，请勿vortex避免产生气泡，影响定量结果。Master Mix经混匀短暂离心后即可使用。加样过程中吹打要轻，如果操作不慎Master Mix起泡，需再次离心方可使用。

4. 由于本品检测灵敏度极高，易被空气中气溶胶污染。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液枪和带滤芯的枪头。

5. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（Cat#N132062），以有效去除RNA样品中残留的基因组。

6. 本产品仅用于科研。

使用说明

1. 模板处理

2×Color qPCR Fluore Green Master Mix (No Rox)中包含蓝色染料，10×Dilution Buffer为专用黄色浓缩模板稀释液。使用过程中，如需要进行模板示踪，则需稀释到1X作为模板稀释液使用，然后进行qPCR检测；如不需要进行模板示踪，则不使用Dilution Buffer即可。

模板类型	10×Dilution Buffer使用方式*	Dilution Buffer终浓度
cDNA溶液、溶解的质粒、基因组	若要稀释模板，则先使用无菌超纯水将模板稀释至目标浓度，后在每9 μL模板中加入1 μL 10×Dilution Buffer。	1×
DNA粉末	使用无菌超纯水将10×Dilution Buffer 稀释至1×，使用合适体积的1×Dilution Buffer作溶剂溶解对应的DNA粉末。	1×

【注】：*实际使用过程中也可按需使用其他方案，保证最终模板中Dilution Buffer浓度为1×即可。

2. 推荐qPCR反应体系

组分	体积 （μL）***	体积 （μL）***	终浓度
2× Color qPCR Master Mix (No Rox)	25	10	1×
Forward Primer (10 μM)*	1	0.4	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)*	1	0.4	0.2 μM
模板DNA/cDNA**	x	x	-
无菌超纯水	Up to 50	Up to 20	-

【注】：

*通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

**如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10，最佳模板加入量以保证扩增得到的Ct值在20-30个循环为宜。

***推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性；上机前需充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

3. 反应程序

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	2 min	1
变性	95℃	10 sec	40
退火/延伸*	60℃	30 sec**
熔解曲线阶段*	仪器默认设置		1

【注】：

*退火温度和时间：请根据引物TM值和目的基因的长度进行调整。

**荧光信号采集：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置。

***熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

4. 引物设计指南

1) 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2) 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3) 引物碱基分布均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4) 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5) 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6) 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

5. 适用机型

本产品中不包含用以校正孔与孔之间荧光信号误差的ROX Reference Dye，适用于以下荧光定量PCR仪：

Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ; MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Cepheid SmartCycler;

Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Illumina Eco qPCR;

Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science LightCycler 480;

Thermo Scientific PikoReal Cycler;

及其他不需要添加ROX Reference Dye的荧光定量PCR仪。