2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)；2×高保真长片段快速PCR预混液（含染料）

产品简介

2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)是即用型2×预混合溶液，包含High-Fidelity DNA Polymerase，dNTPs以及优化的缓冲体系，预混液中含有预先添加的电泳指示剂，PCR产物可直接进行电泳，扩增产物为平末端，延伸速度为10 sec/kb。其保真性是Taq DNA聚合酶的83倍，是普通Pfu DNA 聚合酶的9倍，适用于复杂模板扩增。2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，反应体系只需加入引物和模板即可。另外，该产品还含有特异保护剂，使得预混液反复冻融后仍可维持稳定活性。

产品信息

货号	N132017E	N132017S	N132017M
规格	250 μL	1 mL	5×1 mL

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅用于科研。

使用说明

1，冰上融化试剂 ，混匀后备用。

2，冰上配制表 1 中的 PCR 扩增反应液。配制完成后充分混匀离心。

3，若模板为粗提样本 ，建议添加体积不超过反应体系的 5%。

表1. PCR 扩增反应体系

组分	体积  (µL)
模板(10~200ng)	x
正向引物(10  μM)*	2
反向引物(10  μM)*	2
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)	25
ddH2O	Up to 50

*PCR 反应体系中引物终浓度范围0.4~1μM，引物终浓度过低，会影响扩增效果，若扩增效果不理想，可适当提高引物添加量，提升检出率。

4，将PCR管转移到PCR仪根据表2进行片段扩增。

5，推荐PCR扩增程序

表2. PCR 扩增反应程序

温度	时间	循环数
98°C	30 sec	1
98°C	10 sec	30-35（根据实验要求）
60°C*	5 sec
68°C~72°C**	5~10 sec/kb
72°C	2 min	1
4°C	Hold	-

*退火温度推荐60°C，也可根据需要，设立温度梯度摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间为5 sec ，可以在5-20 sec 内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。

**延伸温度和时间：10 kb以上长片段或较高GC片段扩增，推荐使用68°C，10 kb及10 kb以下片段且gc在40%~60%的片段扩增，可以尝试72℃延伸。当扩增效果不理想时，延伸速率根据实际结果可在5 sec/kb~10 sec/kb之间进行调整，扩增片段＜10 kb时，延伸速率可选择5 sec/kb，当扩增片段≥10 kb时，延伸速率可选10 sec/kb。

6，吸取 5~8 µL 扩增产物，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测是否扩增出正确条带。

应用示例

1，Overlap PCR

1）扩增子1、扩增子2制备

表3. PCR反应体系配制（50 μL体系）

组分	使用量
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)	25 μL
模板 1 DNA、模板 2 DNA	10~100 ng
一轮引物 F1（10  μM）、一轮引物 F2（10  μM）	2 μL
一轮引物 R1（10  μM）、一轮引物 R2（10  μM）	2 μL
ddH2O	To 50 μL

表4.一轮PCR程序

温度	时间	循环数
98°C	30 sec	1
98°C	10 sec	30-35（根据实验要求）
60°C	5 sec
72°C	10 sec/kb
72°C	2 min	1
4°C	Hold	-

2）Overlap PCR（两扩增子融合）

表5.二轮PCR反应体系配制（50 μL体系）

组分	使用量
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)	25 μL
一轮扩增产物1（扩增子1）	2~4μL
一轮扩增产物1（扩增子2）	2μL
一轮引物F1（10 μM）	2μL
一轮引物R2（10 μM）	2 μL
ddH2O	To 50 μL

表6.二轮PCR程序设置（与一轮程序相同）

温度	时间	循环数
98°C	30 sec	1
98°C	10 sec	30-35（根据实验要求）
60°C	5 sec
72°C	10 sec/kb
72°C	2 min	1
4°C	Hold	-

【注】若Overlap产物杂带较多，可以考虑将一轮扩增产物（扩增子1、扩增子2）纯化后，再做二轮扩增。

2，质粒扩增

表7 .PCR 反应体系配制（50 μL体系）

组分	使用量
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)	25 μL
pCAMBIA2301	10~100 ng
正向引物 F（10 μM）	2 μL
反向引物 R（10 μM）	2 μL
ddH2O	To 50 μL

表8.PCR程序设置

温度	时间	循环数
98°C	3 min	1
98°C	10 sec*	30-40（根据实验要求）
60°C**	5 sec
72°C***	10 sec/kb
72°C	2 min	1
4°C	Hold	-

*若质粒为结构紧密的超螺旋，可以适当延长变性时间。

**退火温度推荐使用60°C，也可根据需要，设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度，当产量低时可下调退火温度，当产物特异性差时，则上调退火温度。推荐退火时间为5 sec，可以在5-20 sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。

***延伸温度和时间：10 kb以上长片段或较高GC片段扩增，推荐使用68°C，10 kb及10 kb以下片段且gc在40%~60%的片段扩增，可以尝试72℃延伸。当扩增效果不理想时，延伸速率根据实际结果可在5 sec/kb~10 sec/kb之间进行调整，扩增片段＜10 kb时，延伸时间可选5 sec，当扩增片段≥10 kb时，延伸速率可选10 sec/kb。