产品简介

TUNEL FITC 凋亡检测试剂盒主要用来检测组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核 DNA 的断裂情况。细胞在发 生凋亡时 ，会激活一些 DNA 内切酶 ，这些内切酶会切断核小体间的基因组 DNA ，此时抽提 DNA 进行电泳 检测 ，可以发现 180-200 bp 的 DNA ladder。在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT） 的作用下 ，在基因组  DNA 断裂时暴露出的 3 ´-羟基（3 ´-OH）末端掺入 FITC-12-dUTP ，从而可以用荧光显微镜或流式细胞仪   检测细胞的凋亡情况。

本试剂盒对该标记反应进行了优化，采用最适宜比例的 FITC-12-dUTP 和未标记 dNTP 进行 3 ´-OH 末端的 核苷酸掺入，使得同一个断裂的 DNA 片段末端可以形成更长的“标记尾巴”，减少了相邻掺入 dNTP 上标 记基团的空间位阻 ，增加每个断裂片段上的荧光基团数目 ，降低荧光基团相邻后可能造成的聚集和淬灭 ， 从而提高检测灵敏度 ，减少非特异性反应。本试剂盒可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况 ，也 可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

 

组分信息

组分编号	组分名称	C331412E	C331412S	C331412M
C331401-A	5×Equilibration Buffer	750 μL	1.25 mL×2	1.25 mL×3
C331401-B	FITC-12-dUTP Labeling Mix	100 μL	250  μL	250 μL×2
C331401-C	Recombinant TdT Enzyme	20 μL	50 μL	50 μL×2
C331401-D	Proteinase K (2 mg/mL)	40 μL	100 μL	100 μL×2
C331401-E	DNase I (1 U/ μL)	5 μL	12.5 μL	25 μL
C331401-F	10×DNase I Buffer	100 μL	250 μL	500 μL

 

储存条件

冰袋（wet ice）运输。本试剂盒储存在-20℃ ,  FITC-12-dUTP Labling Mix 避光储存于-20℃ ,  保质期为二年。

 

注意事项

1.     需自备用于洗涤细胞的 PBS ，用于封片的抗荧光淬灭封片液 ，用于固定的 4%多聚甲醛。

2.     如需染核 ，需自备 DAPI（2 μg/mL）或 PI（1 μg/mL）。

3.     如果用流式细胞仪 ， 自备 PI（1 μg/mL）和 DNase Free RNase A。

4.     为了您的安全和健康 ，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5.     本产品仅用于科研。

 

使用说明

一、样品准备

A.     石蜡包埋组织切片

1.     室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡 5 min ，重复一次 ，以彻底脱掉石蜡。

2.     室温下用 100%乙醇浸泡切片 5 min ，重复一次。

3.     室温下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗 1 次 ，每次 3 min。

4.     用 PBS 轻轻润洗切片 ，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时 ，可用石蜡笔或疏水笔  在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干 燥 ，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

5.     配制 Proteinase K 工作液：按 1:100 的比例 ，用 PBS 作为稀释液来稀释 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其终浓度为 20 μg/mL。

6.     每个样本上滴加 100 μL 上述 Proteinase K 工作液 ，使其被全部覆盖 ，室温孵育 20 min。

7.     注：Proteinase K 帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续 洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。未得到更好的 结果 ，可能需要优化 Proteinase K 孵育的时间。

8.     用 PBS 溶液润洗样本 ，轻轻去掉多余液体 ，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的 样本放在湿盒中保存样本的湿润。

B.    组织冰冻切片

1.     将玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液（溶于 PBS） 中固定 ，室温下孵育 15 min。

2.     轻轻去掉多余液体 ，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。

3.     将玻片浸没在 PBS 溶液中 ，室温孵育 15 min。

4.     轻轻去掉多余液体 ，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时 ，可用石蜡笔或疏水笔在样 品周围描绘样品分布的轮廓 ，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中 ，切勿让样品干燥， 处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

5.     配制 Proteinase K 工作液：按 1:100 的比例 ，用 PBS 作为稀释液来稀释 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其终浓度为 20 μg/mL。

6.     每个样本上滴加 100 μL 上述 Proteinase K 工作液 ，使其被全部覆盖 ，室温孵育 10 min。

【注】 Proteinase K 帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗 涤步骤中从载波片上脱落的风险 ，过短则可能造成透性处理不充分 ，影响标记效率。未得到更好的结果 ， 可能需要优化 Proteinase K 孵育的时间。

7.     用 PBS 溶液润洗样本 2-3 次。

8.     轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本 的湿润。

C.    细胞样品

【细胞爬片的准备】

1. 在 Lab-Tek 载玻片小室（Chamber Slides）上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后 ，用 PBS 洗 2 遍 载玻片。

【细胞涂片的制备（以多聚赖氨酸包被的载玻片为例）】

1. 准备多聚赖氨酸包被的载玻片：吸取 50–100 μL 0.01% (w/v)多聚赖氨酸水溶液 ，滴至每一片预清洗 过的玻璃载玻片的表面。在将要用于固定细胞的区域将多聚赖氨酸溶液涂散为一薄层。待载玻片晾干之后 ，迅速用去离子水漂洗 ，然后让包被后的载玻片在空气中晾干 30-60 min。包被后的载玻片能在 室温储存数月。

2. 以约 2×10⁷个细胞/mL 的浓度将细胞重悬于 PBS 中 ，吸取 50-100 μL 细胞悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上 ，用一片干净的载玻片轻柔的涂开细胞悬液。

按照以下步骤对细胞样品进行处理：

1. 固定细胞 ，将载玻片浸入装有 4%新鲜配制于 PBS 中的多聚甲醛的染色缸中 ，在 4℃放置 25 min。

2. 洗涤载玻片 ，将其浸入 PBS 中 ，室温放置 5 min。重复用 PBS 洗一次。

3. 轻轻去掉多余液体 ，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时 ，可用石蜡笔或指甲油在样 品周围描绘样品分布的轮廓 ，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中 ，切勿让样品干燥， 处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

4. 每个样本上可浸于 0.2%配制于 PBS 中的 Triton X-100 溶液中，室温孵育 5 min 进行通透处理（Protein ase K 处理容易使细胞脱落）。

5. 在盛有 PBS 溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本 2-3 次。

6. 轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本 的湿润。

二、DNA 酶处理阳性对照的步骤（可选） 

1. 在样本通透处理后，用 DNA 酶 I 处理细胞来准备阳性对照载玻片。该流程通常会引起被处理的大多数 细胞显现绿色荧光。

【注】 DNA 酶 I 处理固定的细胞会引起染色体 DNA 的断裂 ，产生许多可标记的 DNA 3’-末端。

2. 按 1:10 的比例用去离子水稀释 10×DNase I Buffer(每个样本需用 200 μL 1×DNase I Buffer，即需  要用 20 μL 10×DNase I Buffer 和 180 μL 去离子水混合稀释) ，取其中100 μL滴加到已通透的样本上 ，室温孵育 5 min。  向剩余 100 μL 1×DNase I Buffer 中加 1 μL DNase I (1U/μL) ，使其终浓度为10 U/mL。

3. 轻轻叩掉液体 ，加入100 μL含 10 U/mL DNase I  的缓冲液 ，室温孵育 10 min。

4. 轻叩载玻片 ，去掉多余的液体 ，并将载玻片在装有去离子水的染色缸中彻底洗 3-4 次。

【注】 阳性对照载玻片必须使用单独的染色缸 ，否则阳性对照载玻片上残余的 DNase I  可能会在实验载玻 片上引入高背景。

三、标记与检测

1. 按 1:5 的比例用去离子水稀释 5×Equilibration Buffer。

2. 每个样本滴加 100 μL 1×Equilibration Buffer 使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育 10-30 min。或者将载玻片放入一个含有  1×Equilibration Buffer 的缸中 ，保证缓冲液没过样本。在平衡细胞的同  时在冰上解冻 FITC-12-dUTP Labling Mix，并且依照表 1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性 对照反应的 TdT 孵育缓冲液。对于面积小于 5 cm2 的一个标准反应 ，其体积是 50 μL，用 50 μL 乘以 实验和阳性对照反应的数目来确定所需 TdT 孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例 的增大试剂体积。

表 1. 准备用于实验的和可选阳性对照反应的 TdT 孵育缓冲液

组分	体积  (μL /50 μL 体系）
ddH2O	34
5×Equilibration Buffer	10
FITC-12-dUTP Labling Mix	5
Recombinant TdT Enzyme	1

阴性对照体系：准备一份不含 TdT 酶的对照孵育缓冲液 ，用 ddH₂O 替代 TdT 酶。

3. 在平衡后的区域周围用吸水纸洗掉 100 μL 1×Equilibration Buffer 中的大部分 ，然后在 5 cm2 面积 的细胞上加入 50 μLTdT 孵育缓冲液。不要让细胞干掉。这之后的操作 ，载玻片要避光。

4. 把塑料盖玻片盖在细胞上以保证试剂的平均分布，在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾。将载玻片置于 湿盒内 ，在 37℃孵育 60 min。将湿盒用铝箔纸包裹以避光。

注：塑料盖玻片在使用前可以切成两半。折起盖玻片的边缘以便于移除和操作。

5. 移除塑料盖玻片 ，并将切片置于 PBS 溶液中室温孵育 5 min。

6. 轻轻去掉多余液体 ，换用新鲜的 PBS 溶液室温孵育 5 min ，重复一次。

7. 用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的 PBS 溶液。注意：为了降低背景 ，载玻片在用 PBS 洗一遍后 ，可 再用含 0.1% Triton X-100 和 5 mg/mL BSA 的 PBS 洗 3 次 ，每次 5 min ，这样可将游离的未反应标 记物清除干净。

8. 样本在染色缸中染色 ，在黑暗中将载玻片浸入装有 PI 溶液（1 μg/mL ，用 PBS 新鲜配制并稀释） 的 染色缸 ，室温放置 5 min。可选操作：样本在染色缸中染色 ，在黑暗中将载玻片浸入装有 DAPI 溶液 （2 μg/mL ，用 PBS 新鲜配制并稀释）的染色缸 ，室温放置 5 min。

9. 洗涤样本 ，将载玻片浸入去离子水中 ，室温放置 5 min ，重复 2 次 ，总共洗 3 次。

10. 叩干载玻片上多余的水并且用吸水纸擦拭细胞周边的区域。

11. 立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在 520±20 nm 的荧光下观察绿色荧光；在＞620 nm 下观察 PI 的红色荧光 ，或在 460 nm 观察蓝色的 DAPI。如有必要 ，载玻片能在 4℃黑暗条 件下存放过夜。PI/DAPI 能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色 ，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP 掺入而定位的绿色荧光。

四、利用流式细胞术检测悬浮细胞

1. 将 3-5×10⁶个细胞用 PBS 在 4℃离心（300×g）洗两次 ，然后重悬在 0.5 mL PBS 中。

2. 固定细胞 ，加入 5 mL 1%配制于 PBS 中的多聚甲醛溶液 ，冰上放置 20 min。

3. 细胞在 4℃ ,  300×g 离心 10 min ，去上清并且重悬于 5mL PBS。重复洗一次 ，并用 0.5 mL PBS 重 悬细胞。

4. 通透细胞，加入 5 mL 冰上预冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 小时。细胞能在 70%乙醇中-20℃条件下保存一周 ，或者 ，细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透 ，室温放置 5 min。