产品简介

Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒是用红色荧光染料PE（Phycoerythrin）标记的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。

检测原理：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。7-AAD是一种核酸染料，同PI有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将Annexin V-PE与7-AAD联合使用时，7-AAD则被排除在活细胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Annexin V-PE和7-AAD结合染色呈现双阳性（Annexin V+/7-AAD+）。

产品规格

货号	C331407E/C331407S/C331407M
规格	20 T/50 T/100 T

组分信息

组分编号	组分名称	C331407E	C331407S	C331407M
C331407-A	重组人Annexin V/PE*（rh Annexin V/PE）	100 μL	250 μL	500 μL
C331407-B	7-AAD Viability Staining Solution（20 µg/mL）	200 μL	500 μL	1 mL
C331407-C	4×Binding Buffer	4 mL	10 mL	20 mL

*来源于大肠杆菌（E.coli），分子量为35.8 KDa，纯度＞98%（SDS-PAGE & HPLC）

储存条件

冰袋（wet ice）运输。本试剂盒中所有组分均在4 ℃保存，勿冰冻。Annexin V-PE、7-AAD需避光保存。一年有效。

注意事项

1. 由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2. 贴壁细胞的消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免机械损伤。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。尽量不用含EDTA的胰酶消化液，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3. 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。血小板含有PS，可与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并以200 g离心洗去血小板。
4. 试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体集中至管底，避免开盖时液体洒落引起损失。
5. Annexin V-PE和PI是光敏物质，操作时请注意避光。
6. 7-AAD为潜在致癌物，操作时请采取防护措施，穿防护服、戴手套等。
7. 本产品仅用于科研。

使用说明

一、样品染色

1. 悬浮细胞：300 g，4℃离心5 min收集细胞。贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。
2. 配制1×Binding Buffer：用去离子水4倍稀释4×Binding Buffer（4 mL 结合缓冲液+12 mL 去离子水）。
3. 用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300 g，4℃离心5 min。
4. 加入1×Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1-5×10⁶细胞/mL。
5. 取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-PE，轻轻混匀后于室温避光孵育5min。
6. 加入10 μL PI（20 µg/mL）。
7. 加入400 μL PBS Buffer，混匀，样品在1小时内检测。

【注意】为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

二、观察检测

1. 流式细胞仪

1. 用流式细胞仪检测，Annexin V-PE的激发波长Ex=488nm；发射波长Em=578 nm，发出橙红色荧光，建议使用FL2通道检测；7-AAD的激发波长Ex=546 nm；发射波长Em=647 nm，发出红色荧光，建议使用FL3通道检测。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），PE为横坐标，7-AAD为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅呈很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅呈较强的橙红色荧光，晚期凋亡细胞呈橙红和红色荧光双重染色。
2. 荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

2. 荧光显微镜

1. 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。
2. 用PBS洗涤细胞两次。
3. 在500 μL的Binding Buffer 中加入1 μL Annexin V-PE，5 μL 7-AAD染液混匀。
4. 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖。
5. 室温避光孵育5 min。
6. 将盖玻片倒置于载玻片上，在荧光显微镜下用双色滤光片观察。滤光片（罗丹明）观察Annexin V-PE 荧光信号呈橙红色；用激发波长546 nm，发射波长647 nm，观察7-AAD荧光信号呈红色。