产品简介

Calcein-AM/PI Double Stain Kit 活死细胞双染试剂盒主要通过两种染料Calcein-AM和PI对细胞进行活死 鉴别。

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。它穿透细胞膜进入细胞后能够被细胞内的酯酶剪切形成Calcein，从而被滞留在细胞内，发出强绿色荧光。

因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团 ，增加了疏水性 ，它能够更轻易穿透活细胞膜。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA)相比 ，由于Calcein-AM细胞毒性极低 ，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，且不会抑制任何细胞功能，如细胞增殖和淋巴球的趋化性。死细胞缺乏酯酶活性 ，因此，Calcein-AM常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用 ，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide ，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm）。Calcein 和 PI-DNA 都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm 激发，仅可观察到死细胞。

根据我司优化的实验体系 ，单次就 200 µL 细胞悬液进行染色 ，C331308E 和 C331308S 分别可以做 500 次和 1000 次检测。

 

组分信息

组分编号	组分名称	C331308E	C331308S
C331308-A	Calcein-AM Solution（2 mM）	50 μL	50 μL×2
C331308-B	PI Solution（1.5 mM）	150 µL	150 µL×2
C331308-C	10×Assay Buffer	50 mL	100 mL

 

储存条件

冰袋运输；其中 A 组分和 B 组分需-20℃避光干燥保存 ，C 组分-20℃保存 ，经常使用可放在 4℃保存。一 年有效。

 

注意事项

1. 由于 Calcein-AM 对湿度非常敏感，Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量 ，分装密封保存。Calcein-AM 工作液必须现配现用。

2. 碘化丙啶（PI）有一定的致癌性 ，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤 ，需要立即用自来水清洗。

3. 为了您的安全和健康 ，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅用于科研。

 

使用说明

1. 工作液的配制

1.1 1×Assay Buffer（反应缓冲液） 的配制

从冰箱内取出 10×Assay Buffer ，根据单次用量于无菌条件取出适量 ，用去离子水（dH₂O）做 10 倍稀释 以得到 1×Assay Buffer。

1.2 1×染色工作液的配制

1）先将低温保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI 溶液（1.5 mM） 回到室温20-30 min。 注意：第一次使用可对母液进行分装 ，以减少反复冻融次数。

2）取5 µL Calcein-AM 溶液（2 mM）和15 µL PI 溶液（1.5 mM）加入5 mL 1×Assay Buffer ，充分混匀。 此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2  μM ，PI 的工作液浓度为4.5  μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验 ，以确定Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的  探针浓度得到最好的荧光结果。加入500 µL CFDA-SE溶剂到1管CFDA-SE荧光探针中进行溶解，充分混匀即得到1000×的储存液。

【注意】该储存液最好在1个月内使用完毕，最长不超过2个月。剩余储存液请务必分装后于≤-20℃避光干燥保存 ，避免反复冻融，-70℃避光保存可适当延长保存周期。

2.     染色步骤

1）对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000 rpm ，3 min）。 对于悬浮细胞，直接离心（1000 rpm ，3 min）收集细胞。

2）去上清 ，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2~3 次 ，以充分去除残留的酯酶活性。

3）用1×Assay Buffer制备细胞悬液 ，使其密度为 1×10⁵~1×10⁶细胞/mL。

4）取100 µL染色工作液加入200 µL细胞悬液内，混匀，37℃孵育 15 min。注意：如果需要 ，可延长孵育时间至30 min。

5）荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。 另外，使用545 nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下进行检测。

【注意】 可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

a）用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10 min ，或者用70%乙醇孵育细胞30 min，制备死细胞。 

b）用0.1-10 µM 的PI 溶液进行死细胞染色，以得到仅对细胞核染色而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。 

c）用0.1-10 µM 的Calcein-AM进行死细胞染色 ，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色 ，去观察是否活细胞能被染色。