提起“分子克隆”或“载体构建”这两个词，大家可能先想到的是传统酶切酶连法，即用限制性内切酶产生黏性末端，通过T4 DNA连接酶连接两个片段的克隆方法。该方法存在着一些明显的局限，如连接反应时间长，操作繁琐，克隆效率低，酶切位点的选择易受到限制等。为了提高克隆效率，节省反应时间，基于同源重组酶的无缝克隆技术应用而生。与传统酶切酶连技术相比，无缝克隆技术操作简单快速，不受到酶切位点的限制，可一次进行多个片段的拼接，大大的提高了克隆效率。
克隆原理
利用末端同源重组的原理，将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。一步法克隆是基于同源重组原理的高效克隆技术，通过在插入片段的引物两端设计与线性化载体末端同源的序列，利用同源重组酶的外切酶、DNA聚合酶和连接酶活性，将插入片段与载体无缝连接。该方法无需酶切位点，操作简单，克隆阳性率高，适用于单片段或多片段克隆，广泛应用于基因工程和分子生物学研究中。
与传统克隆相比，1-7Fragments One Step Cloning Kit主要有以下优点：
1）无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
2）设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5'端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
3）快速高效：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
4）应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
实验操作流程
线性化载体的制备：酶切或PCR制备线性化载体
插入片段的制备：在目的DNA片段上下游引物的5'端引入15-25 bp左右载体末端同源序列；PCR反应扩增目的片段。
重组反应：按比例混合线性化载体和目的DNA片段进行重组，50℃反应15-20 min。
转化、涂板：将重组产物直接转化后涂平板，阳性克隆鉴定。
单片段高效重组
1-7Fragments One Step Cloning Kit可以有效克隆连接单片段基因。A：重组转化平板。载体（ 10 kb ）和插入片段（1 kb）摩尔比为1:2。C：插入片段PCR鉴定电泳图，M：10000 DNA Marker。载体量：40 ng/6 μL反应体系，反应条件：50℃,15 min。
多片段轻松重组
1-7Fragments One Step Cloning Kit可以有效进行三片段连接。A：重组转化平板。载体（ 11.6 kb ）和插入片段（1 kb + 1.6 kb + 1.8 kb）摩尔比为1:2。C：插入片段PCR鉴定电泳图，M：10000 DNA Marker，菌落PCR长度2.6 kb。载体量：200 ng/20 μL反应体系，反应条件：50℃,20 min。
1-7Fragments One Step Cloning Kit可以有效进行六片段连接。A：重组转化平板。载体（ 11.6 kb ）和插入片段（0.5kb+0.7kb+1kb+1.6kb+1.8kb + 2 kb）摩尔比为1:2。C：插入片段PCR鉴定电泳图，M：10000 DNA Marker，菌落PCR长度2.6 kb。载体量：200 ng/20 μL反应体系，反应条件：50℃,50 min。
长片段重组
1-7Fragments One Step Cloning Kit有效克隆连接超长片段。A：重组转化平板。载体（ 21 kb ）和插入片段（4.5 kb）摩尔比为1:2。C：插入片段PCR鉴定电泳图，M：10000 DNA Marker。载体量：200 ng/20 μL反应体系，反应条件：50℃,40 min。
客户反馈
1-7Fragments One Step Cloning Kit有效克隆连接四片段，菌落数多，阳性率85%以上。
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多片段一步法克隆 |
N132081E | 5 T | 150 | |
| N132081S | 20 T | 500 | ||
| N132081M | 50 T | 1100 |
