实验所用试剂
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试剂货号 |
试剂名称 |
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Celthy SureXcel 3000 Transfection Reagent Celthy SureXcel 3000转染试剂 |
细胞培养与传代（T25）
细胞计数：从培养箱取出细胞，细胞悬液吹打混匀，使用细胞计数仪检测细胞活率及密度。
细胞传代（直接稀释法）：根据计数结果，将细胞按照5E5 cell/mL左右进行细胞传代。
细胞传代（半换液法）：若待传代细胞上清较黄，取出细胞后，使细胞继续保持静置状态，将培养板微微倾斜，使细胞沉于底部，用移液器将细胞上清液去除，再补充新鲜培养基进行计数传代。
细胞传代（离心换液法）：若细胞状态不好，可以通过低速离心进行传代；将待传代细胞悬液移至无菌离心管中，200 ×g 离心3-5分钟，新鲜培养基重悬并计数传代。
注：该细胞状态好的情况下，细胞呈葡萄串样聚集。
细胞转染（96孔板）
一、 实验前准备
1. 细胞准备：转染前800rpm离心，取细胞悬液，进行细胞计数（也可行细活率检测，建议活率95%以上）。按照每个孔3W个细胞接种到96孔板中，每孔加入100 μL完全培养基（指培养基总量）。
2. 试剂准备：
- 质粒DNA： 使用高纯度（如试剂盒提取）的质粒DNA，质粒浓度最好高于1000 ng/μL。
- 转染试剂： 将Celthy SureXcel 3000试剂在4°C冰箱外静置回温，使用前轻轻吹打。
- 无血清培养基： 准备用于稀释DNA和转染试剂的基础培养基（如Opti-MEM）。
二、 转染复合物制备
1. 稀释DNA：取一个无菌离心管，加入5 μL的opti-MEM无血清培养基，再加入0.5 μg质粒DNA，轻轻混匀。然后再加入1 μL的Enhancer增强剂，吹打混匀，获得稀释的质粒DNA溶液。
2. 稀释转染试剂：取另一个无菌离心管， 5 μL的opti-MEM无血清培养基，再加入1 μL的Celthy SureXcel 3000转染试剂轻轻吹打混匀。
3. 混合孵育： 将释好的DNA溶液加入稀释的转染试剂管中，轻轻吹打混匀。室温下静置孵育10-15分钟，以形成稳定的DNA-转染试剂复合物。
三、 细胞转染
1. 加复合物： 将孵育好的DNA-转染试剂复合物逐滴均匀地加入到细胞培养基中，轻轻摇晃培养板使其混匀。
2. 孵育： 将细胞放回37°C、5% CO₂培养箱中培养。
四、 转染后处理
1. 换液： 转染后4-6小时，仔细观察细胞状态。若出现明显毒性，应吸弃含复合物的培养基，更换为2 mL新鲜预热的完全培养基。若细胞状态良好，可以不换液。
2. 检测： 继续培养24-72小时后，根据实验设计（如表达荧光蛋白、检测mRNA或蛋白水平）进行转染效率或功能检测。
小贴士：
1、如果转染后有显著的细胞毒性，可以在6h换液或将增强剂用量减半，可以避免细胞毒性问题；
2、如果转染效率比较低，可以通过提高转染试剂用量，能够有效提高转染效率；
3、稀释质粒和转染试剂，最好使用opti-MEM；
4、转染试剂兼容血清和双抗，但是稀释质粒和转染试剂用的必须是无血清无双抗培养基。
实验结果分析
在Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞转染质粒DNA，用Celthy SureXcel 3000和进口品牌T3000转染，并通过荧光显微镜观察转染效率。
数据来源：重医附一院
使用 Celthy SureXcel 3000转染试剂在Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞转染质粒DNA，结果显示，Celthy SureXcel 3000转染试剂能够高效转染。
不同培养皿Celthy SureXcel 3000转染试剂用量使用指南
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培养容器 |
培养基用量 |
DNA转染 |
siRNA转染(终浓度50 nM) |
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培养基体积 |
复合物中Opti-MEM体积 |
DNA （μg） |
Celthy SureXcel 3000 转染试剂（μL） |
Enhancer转染 增强剂（μL） |
siRNA体积 (初始浓度20 μM) |
Celthy SureXcel 3000转染试剂（μL） |
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96孔 |
100 μL |
2×5 μL |
0.1 |
0.2 |
0.2 |
0.25 μL |
0.3 |
|
48孔 |
250 μL |
2×12.5 μL |
0.25 |
0.5 |
0.5 |
0.625 μL |
0/75 |
|
24孔 |
500 μL |
2×25 μL |
0.5 |
1 |
1 |
1.25 μL |
1.5 |
|
12孔 |
1 mL |
2×50 μL |
1 |
2 |
2 |
2.5 μL |
3 |
|
6孔 |
2 mL |
2×125 μL |
2.5 |
5 |
5 |
5 μL |
7.5 |
|
60 mm |
5 mL |
2×250 μL |
5-10 |
10-20 |
10-20 |
12.5 μL |
20 |
|
10 cm |
10 mL |
2×500 μL |
15-25 |
30-50 |
30-50 |
25 μL |
40 |
|
T25 |
6 mL |
2×250 μL |
6-12 |
12-24 |
12-24 |
15 μL |
24 |
|
T75 |
15 mL |
2×750 μL |
20-40 |
40-80 |
40-80 |
37.5 μL |
60 |
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