在RT-qPCR实验中，逆转录引物的选择也是很重要的一环。根据不同实验目的，逆转录引物的选择大相径庭。今天我们就来学习下如何正确选择逆转录引物。
逆转录引物介绍
Oligo（dT）
Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，因此，主要用于逆转带有Poly(A)尾的mRNA。例如模板为真核生物来源，Oligo(dT)可与mRNA的3’Poly(A)尾配对，有利于长链或全长mRNA的逆转录。但是，其对RNA样品的质量要求较高，RNA不能降解，否则全长cDNA合成量会大量减少。
随机引物
随机引物是指当特定mRNA由于含有使逆转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体这一不特异的引物来拷贝全长mRNA，一般6到8个碱基，许多随机引物组成一套引物组。它可用于mRNA、rRNA、tRNA等各种RNA的逆转录，对于目标区域具有复杂二级结构/GC含量较高，或者来源为原核生物的模板也同样适应。
基因特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计的。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。特异性引物一般用于一步RT-qPCR实验中。
逆转录引物优劣势比较
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引物类型 |
结合部位 |
优点 |
缺点 |
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Oligo(dT) |
真核生物mRNA3’端poly(A)尾 |
可合成全长cDNA |
1、仅扩增有polyA尾的mRNA 2、对模板质量要求高 |
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随机引物 |
RNA的许多随机可结合部位 |
适合复杂结构和微量模板 |
特异性低，小片段多 |
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基因特异性引物 |
特异性互补序列 |
特异性强，灵敏度高 |
仅合成特定的序列 |
逆转录引物的选择
RNA类型：
1、真核生物mRNA
2、miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板
引物选择：Oligo(dT)
原因：
1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以Oligo(dT)引物结合
2、miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾，故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合
RNA类型：
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等无3’端poly(A)尾的模板
2、长度比较长、有二级结构存在及微量样本的模板
引物选择：随机引物
原因：
随机引物可以在任意位点和RNA结合并开始反转
RNA类型：
1、已知基因序列的模板
2、miRNA增加茎环结构的模板
引物选择：基因特异性引物
原因：
1、针对特定序列设计的反转录引物
2、miRNA（茎环法）的反转录，需要根据基因序列设计对应的引物
【注】为提高反转录效率，并保障获得更加完整的cDNA，建议将Oligo(dT)和随机引物混合使用。
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